無菌操作技術(shù)不僅在微生物學(xué)研究和應(yīng)用上起著舉足輕重的作用，在許多生物技術(shù)中也被廣泛應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等。

 

無菌室，微生物實驗室內(nèi)專辟的一個小房間，室外設(shè)一個緩沖間，緩沖間的門和無菌室的門不要朝向同一方向，以免氣流帶進(jìn)雜菌。無菌室和緩沖間都必須密閉，無菌室內(nèi)的地面、墻壁必須平整，不易藏污納垢、便于清洗，室內(nèi)裝備的換氣設(shè)備必須有空氣過濾裝置。工作臺的臺面應(yīng)該處于水平狀態(tài)，無菌室和緩沖間都裝有紫外線燈（距離工作臺面1米），工作人員進(jìn)入無菌室應(yīng)穿戴滅過菌的服裝、帽子。

 

超凈臺，主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺面上部包括微生物在內(nèi)的各種微小塵埃，通過電動裝置使空氣通過高效過濾器具后進(jìn)入工作臺面，使臺面始終保持在流動無菌空氣控制之下。在條件較困難的地方，也可以用木制無菌箱代替超凈臺（正面開有兩個洞，不操作時用推拉式小門擋住，操作時可以將雙臂伸進(jìn)去；正面上部裝有玻璃，便于在內(nèi)部操作，箱內(nèi)部裝有紫外線燈，從側(cè)面小門可以放進(jìn)去器具和菌種、細(xì)胞株等）。

 

微生物的培養(yǎng)

 

在微生物的培養(yǎng)過程中，要保持培養(yǎng)物純凈性；培養(yǎng)微生物的要*，是為所需要的微生物提供良好的生存環(huán)境，同時阻止或抑制其他微生物的生長。

 

（一）培養(yǎng)基

1.認(rèn)識培養(yǎng)基的基本組成成分，從生物體構(gòu)成的基本元素這一角度理解培養(yǎng)基中為什么都需要具備這些基本成分。

2.培養(yǎng)基的用途和種類：液體和固體兩大類。

3.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方；盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和無機(jī)鹽。

4.培養(yǎng)基是否合格（無菌試驗）：培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長（液體不變渾濁），說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

 

（二）無菌技術(shù)

 

1.  無菌技術(shù)的概念
無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。日常的生活環(huán)境中，每時每刻每處都存在著微生物，任何一個不經(jīng)意的動作都可能將某種微生物引入到培養(yǎng)物中。在具備無菌環(huán)境和獲得無菌材料后，還要始終保持無菌狀態(tài)，才能對某種特定的已知微生物進(jìn)行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現(xiàn)象，在微生物學(xué)叫做污染雜菌。防止污染是微生物學(xué)工作中十分關(guān)鍵的技術(shù)：徹底滅菌和防止污染是無菌技術(shù)的兩個方面。此外，要有效避免操作者自身被微生物感染，還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經(jīng)過基因工程改造了的本來自然界不存在的微生物從我們的實驗容器中逃逸到外界環(huán)境中去（生物安全）。無菌操作非常重要，無論是倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。

 

2.  消毒與滅菌的概念

（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（需要滅菌）

（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（需要滅菌）

（3）實驗操作者的雙手（需要消毒）

（4）接種環(huán)、針、涂布棒：灼燒滅菌（外焰）。

 

3.倒平板

（1）滅菌后，培養(yǎng)基冷卻到55 ℃后應(yīng)及時進(jìn)行倒平板操作，如果不能及時操作，需要將培養(yǎng)基放到55℃左右的電熱箱中保溫，以防止瓊脂凝固（用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了）；每個72mm培養(yǎng)皿需要培養(yǎng)基12~15ml。

（2）為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

（3）平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

（4）在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此**好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。

 

4.  平板劃線

（1）為什么在操作的**步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的**步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的細(xì)菌，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死細(xì)菌。

（3）在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，**終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。

 

5.  涂布平板
應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”，涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍，等等。

 

細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，操作技術(shù)不規(guī)范，也會導(dǎo)致污染。因而，所有操作都要**大可能的保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。（心中有數(shù)）

 

（一）培養(yǎng)前準(zhǔn)備
在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這樣可以避免開始實驗后，因器材不全往返拿取而增加污染機(jī)會。

 

（二）操作區(qū)消毒
無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用70酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。實驗用品，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺，同時紫外線消毒。

 

（三）洗手和著裝
原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿裝細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用70%酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

 

（四）火焰消毒
在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，shou先要點燃酒精燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處進(jìn)行。但要注意：燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷；吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中；開啟、關(guān)閉長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細(xì)胞；另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。

 

（五）操作
開啟無菌操作臺風(fēng)機(jī)運轉(zhuǎn)10分鐘后，才可開始實驗操作，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應(yīng)及時移出,以利氣體流通。實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。工作自始**終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口（敞開直立可增加落菌污染機(jī)會）。吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，不要在打開的容器正上方操作實驗容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。瓶口**易污染，加液時如吸管、吸頭尖碰到瓶口、瓶外，則應(yīng)將吸管換掉。每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。驗結(jié)束后，將實驗物品帶出工作臺，如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個實驗，則用70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風(fēng)機(jī)運轉(zhuǎn)10分鐘后，才可進(jìn)行下一個實驗操作。

 

（六）安全
工作人員應(yīng)注意自身的安全，必須穿戴實驗衣與手套后才進(jìn)行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心,并選擇適當(dāng)?shù)燃壍臒o菌操作臺(**少兩級)。操作過程中，應(yīng)避免氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如DMSO（二甲基亞砜），并避免尖銳物品傷人等。

 

（七）定期檢測下列項目

 

1. CO2 鋼瓶的CO2 壓力

 

2.  CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)； CO2 培養(yǎng)箱定期消毒。

 

3.   無菌操作臺內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300 小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。